Fue fundado a finales del siglo XV por el Cardenal Cisneros como monasterio de monjas franciscanas, colegio de doncellas y hospital de mujeres. Se situó en la actual calle de San Juan, donde ha permanecido del antiguo convento la nave de la iglesia, restaurada como sala de exposiciones y conocida hoy día como Casa de la Entrevista.
Se conservan también zonas de lo que fue convento en el colegio Cardenal Cisneros y en las dependencias municipales situadas junto a la referida sala de exposiciones.
Desde 1884, el convento de san Juan de la Penitencia se sitúa en el que fue colegio-convento de agustinos de San Nicolás de Tolentino, construido a partir de 1616. El interior de la iglesia es una bella muestra de la arquitectura barroca madrileña.
Llama la atención la pequeña sacristía ovalada del siglo XVIII, situada en el lado de la epístola. En este espacio, podemos admirar el museo del convento, en el que sobresalen piezas como una copia del testamento de Cisneros, el báculo del Cardenal, su pectoral y obras de arte de los siglos XVI y XVII.
Las monjas del convento de San Juan de la Penitencia de Alcalá de Henares fueron las testamentarias de Cisneros, razón por la que conservan estos recuerdos del Cardenal.